Theodore Dubois nacque in una famiglia di modeste condizioni economiche.
Nel 1854 venne ammesso al Conservatorio di Parigi dove ebbe come docenti A. F. Marmontel, F. Benoist e A. Thomas, figure di spicco nel panorama musicale francese. Si distinse durante gli studi al Conservatorio e nel 1861 vinse l’ambito Prix de Rome.
Dubois iniziò abbastanza presto ad esercitare l’attività di organista: nel 1855 nella Cattedrale di San Luigi degli Invalidi, nel 1858 a santa Clotilde, nel 1868 nella Chiesa della Madeleine come Maetro del Coro e in seguito, nel 1877, come organista titolare dopo C. Saint-Saëns.
Dal 1871 iniziò anche l’attività di insegnamento al Conservatorio di Parigi come docente di armonia, poi di composizione. Fu autore di vari scritti teorici e metodi musicali di successo, ebbe numerosi allievi tra i quali Paul Dukas.
Nel 1894 fu eletto membro dell’Académie des Beaux-Arts, confermando la sua riconosciuta autorevolezza nell’ambiente musicale parigino, e nel 1896 diventò direttore del Conservatorio succedendo ad Ambroise Thomas.
Di formazione e impostazione tendenzialmente conservatrice, Dubois fu contrario alle innovazioni di Claude Debussy e al modernismo di Maurice Ravel ma anche promotore della nomina di Gabriel Fauré come successore di Jules Massenet alla cattedra di composizione.
Nel 1905, a causa dello scandalo scatenato dall’esclusione di Ravel agli ammessi al Prix de Rome, venne sostituito proprio da Fauré alla guida del Conservatorio.
Dopo il pensionamento si dedicò alla composizione e alla pubblicazione del Trattato di armonia, ancora oggi in uso in vari conservatori. Compositore prolifico, il suo catalogo consta di oltre 500 lavori di tutti i generi musicali. Particolarmente importante è la produzione organistica sacra che è ancora oggi eseguita soprattutto in Francia.